Bakterien, die antiviralen Medikamenten ausgesetzt sind, entwickeln eine Antibiotikakreuzung

Kommunikationsbiologie Band 6, Artikelnummer: 837 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Antivirale Medikamente werden weltweit zur Behandlung und Prophylaxe chronischer und akuter Virusinfektionen eingesetzt. Auch wenn antivirale Medikamente nachweislich auch Off-Target-Effekte auf das Bakterienwachstum haben, ist der mögliche Beitrag antiviraler Medikamente zur antimikrobiellen Resistenz noch unbekannt. Hier untersuchten wir die Fähigkeit verschiedener Klassen antiviraler Medikamente, antimikrobielle Resistenzen zu induzieren. Unsere Ergebnisse belegen die bisher unerkannte Fähigkeit antiviraler Medikamente, die phänotypischen antimikrobiellen Resistenzprofile sowohl der gramnegativen als auch der grampositiven Bakterien Escherichia coli und Bacillus cereus umfassend zu verändern. Bakterien, die Virostatika wie Zidovudin, Dolutegravir und Raltegravir ausgesetzt waren, entwickelten eine Kreuzresistenz gegen häufig verwendete Antibiotika wie Trimethoprim, Tetracyclin, Clarithromycin, Erythromycin und Amoxicillin. Die Sequenzierung des gesamten Genoms antivirenresistenter E. coli-Isolate ergab zahlreiche einzigartige Mutationen einzelner Basenpaare sowie Insertionen und Deletionen mehrerer Basenpaare in Genen mit bekannter und vermuteter Rolle bei der Antibiotikaresistenz, einschließlich solcher, die für Multidrug-Efflux-Pumpen und den Kohlenhydrattransport kodieren und Zellstoffwechsel. Die beobachteten phänotypischen Veränderungen in Verbindung mit genotypischen Ergebnissen deuten darauf hin, dass Bakterien, die in vitro antiviralen Arzneimitteln mit antibakteriellen Eigenschaften ausgesetzt sind, mehrere Resistenzmutationen entwickeln können, die eine Kreuzresistenz gegen Antibiotika verleihen. Unsere Ergebnisse unterstreichen den potenziellen Beitrag des großflächigen Einsatzes antiviraler Medikamente zur Entwicklung und Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen bei Mensch und Umwelt.

Antivirale Medikamente werden weltweit zur Behandlung von Viruserkrankungen eingesetzt, die Millionen von Menschenleben beeinträchtigen. Virostatika schwächen eine Virusinfektion ab, indem sie die Replikationsfähigkeit eines Virus hemmen, oft indem sie auf die Proteine oder Enzyme abzielen, die ein Virus verwendet, um einen Wirt zu infizieren, zu vermehren oder neue Viruspartikel aus ihm freizusetzen1. Neunzig Virostatika sind derzeit (Stand 2017) von der Food and Drug Administration in den Vereinigten Staaten zugelassen, darunter Einzel- und Kombinations-Virostatika gegen Influenzaviren, Hepatitis B und C, Herpes-simplex-Viren 1 und 2 und das humane Immundefizienzvirus (HIV). )2. Weltweit sind schätzungsweise 38 Millionen Menschen mit HIV3 infiziert. Dreihundertfünfundzwanzig Millionen Menschen leben mit Hepatitis B und/oder C4, und allein bei Personen unter 50 Jahren treten über 3,7 Milliarden Fälle des Herpes-simplex-Virus Typ 1 auf5. Weltweit treten jährlich schätzungsweise drei bis fünf Millionen schwere Fälle einer Influenzavirus-Infektion auf6. Da die Zahl der Viruserkrankungen jedes Jahr zunimmt, wird voraussichtlich auch der Einsatz antiviraler Medikamente zunehmen7. Einige Virusinfektionen wie die saisonale Grippe können möglicherweise nur mit einer kurzfristigen antiviralen Therapie behandelt werden; andere wie HIV/AIDS können eine langfristige bis lebenslange antivirale Behandlung erfordern. Darüber hinaus erweitert die anhaltende SARS-CoV-2-Pandemie die Liste der globalen Viruserkrankungen, die mit antiviralen Medikamenten behandelt werden8.

Angesichts des weltweit umfangreichen Einsatzes antiviraler Medikamente müssen auch die unvorhergesehenen Folgen antiviraler Medikamente berücksichtigt werden. Antivirale Medikamente sollen gezielt auf die Virusreplikation abzielen; Virostatika können jedoch Nebenwirkungen außerhalb des Ziels haben, einschließlich der Hemmung des Bakterienwachstums9,10,11,12. Die antibakterielle Aktivität mehrerer antiviraler Medikamente hat im letzten Jahrzehnt zu einem zunehmenden Interesse an der Umnutzung antiviraler Nukleosidanaloga geführt, insbesondere zur Behandlung multiresistenter bakterieller Infektionen13,14,15. Die antibakterielle Aktivität vieler antiviraler Medikamente wirft jedoch auch die Frage auf, ob antivirale Medikamente zur antimikrobiellen Resistenz beitragen können, was das Vorhandensein, die Entwicklung, die Verbreitung und die Behandlung antimikrobieller resistenter Infektionen umfasst. Weltweit ist die Resistenz gegen antimikrobielle Mittel eine der zehn größten Bedrohungen für die menschliche Gesundheit16. Allein in den Vereinigten Staaten gibt es jedes Jahr über 2,8 Millionen antibiotikaresistente Infektionen und über 35.000 Todesfälle aufgrund von Antibiotikaresistenzen17. Die meisten Diskussionen über die Bekämpfung antimikrobieller Resistenzen konzentrieren sich auf den umsichtigen Einsatz verschreibungspflichtiger Antibiotika und Hygiene18,19. Allerdings ist das Verständnis des gesamten Spektrums der Faktoren, die zur antimikrobiellen Resistenz beitragen, noch unvollständig. Nicht-antibiotische Arzneimittel wie antivirale Arzneimittel können ebenfalls zur Entwicklung antimikrobieller Resistenzen auf globaler Ebene beitragen. Es sind jedoch Forschungsarbeiten erforderlich, um ein vollständiges Verständnis darüber zu erlangen, wie Arzneimittel mit antibakteriellen Eigenschaften zu Mutationen bei Bakterien und zu Kreuzresistenzen mit Antibiotika führen können.

Während die antibakteriellen Eigenschaften vieler antiviraler Medikamente nachgewiesen wurden, ist weitgehend unbekannt, ob Bakterien gegen diese antiviralen Medikamente resistent werden können und ob Resistenzmutationen gegen antibakterielle antivirale Medikamente zu einer Kreuzresistenz mit anderen antibakteriellen Wirkstoffen, einschließlich Antibiotika, führen können. Nichtpharmazeutische Verbindungen mit antimikrobieller Wirkung, wie etwa einige Pestizide und Herbizide, tragen nachweislich zur antimikrobiellen Resistenz bei20,21,22. Andere nicht-antibiotische Medikamente wie Antidepressiva und Antiepileptika haben nachweislich letztendlich Einfluss auf die Resistenz, indem sie die Rate des horizontalen Gentransfers erhöhen, dieselben oder ähnliche Ziele wie Antibiotika beeinflussen oder zu Veränderungen der Genexpression führen, die sich auf die Resistenz gegen Antibiotika auswirken23,24 ,25. Daher kann die Untersuchung sowohl der phänotypischen als auch der genotypischen Auswirkungen der Exposition gegenüber nicht-antibiotischen Arzneimitteln wie antiviralen Arzneimitteln auf Bakterien zu einem besseren Verständnis der Kreuzresistenz und der Mechanismen führen, die zur Resistenz führen. Neben allgemein bekannten genetischen Mutationen, die eine Antibiotikaresistenz verursachen, können auch neue Mutationen aufgrund der Exposition gegenüber nicht-antibiotischen Arzneimitteln für die Entstehung einer Antibiotika-Kreuzresistenz verantwortlich sein26. Durch die Durchführung der Sequenzierung des gesamten Genoms können neuartige Resistenzmutationen identifiziert werden, die zur Erklärung von Resistenzphänotypen beitragen27,28.

In dieser Studie untersuchten wir die antibakterielle Wirksamkeit antiviraler Medikamente und das Potenzial für Kreuzresistenzen mit anderen antiviralen Medikamenten und Antibiotika. Mithilfe eines kulturbasierten Ansatzes mit den Modellbakterien E. coli und B. cereus zeigen wir, dass antivirale Medikamente das Potenzial haben, zur Antibiotikaresistenz bei gramnegativen und grampositiven Bakterien beizutragen. Während bereits in anderen Studien die antibakteriellen Eigenschaften einiger antiviraler Medikamente nachgewiesen wurden, gibt es unseres Wissens noch keine andere Arbeit, die darüber berichtet, inwieweit zahlreiche antivirale Medikamente verschiedener Klassen zu einer Antibiotika-Kreuzresistenz führen können. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass antivirale Medikamente mit antibakteriellen Eigenschaften den Phänotyp der antimikrobiellen Resistenz von Bakterien beeinflussen können; Weitere Untersuchungen könnten dazu beitragen, die spezifischen Mechanismen aufzuklären, durch die diese Medikamente und möglicherweise auch andere auf Bakterien wirken und zur Antibiotika-Kreuzresistenz beitragen können.

Vierzehn antivirale Medikamente aus vier verschiedenen antiviralen Klassen (Antiherpetika, nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NRTI), Integrase-Inhibitor (II), nicht-nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NNRTI)) mit einer Reihe unterschiedlicher Ziele/Wirkungsweisen (Ergänzende Daten 1) wurden auf antibakterielle Aktivität gegen E. coli und B. cereus untersucht.

Acht der vierzehn getesteten antiviralen Mittel zeigten konsistente Ergebnisse mit früheren Arbeiten10 und hemmten das Wachstum von E. coli, während nur drei der vierzehn eine antibakterielle Aktivität gegen B. cereus zeigten (Abb. 1). Die antiviralen Medikamente Abacavir, Darunavir, Nevirapin, Tenofovir, Favipiravir und Emtricitabin hatten keinen signifikanten Einfluss auf das Wachstum von E. coli oder B. cereus bis zu 100 μg/ml über 24 Stunden (Ergänzende Abbildung 1, Ergänzende Abbildung 2). . Dolutegravir, Efavirenz und Raltegravir reduzierten das Wachstum sowohl von E. coli als auch von B. cereus signifikant, während die Nukleosidanaloga Aciclovir, Didanosin, Lamivudin, Stavudin und Zidovudin E. coli, jedoch nicht B. cereus, signifikant hemmten (Abb. 1). Bei antiviralen Arzneimitteln mit antibakterieller Wirkung wurde eine Wachstumshemmung typischerweise bei Konzentrationen ≥ 50 μg/ml beobachtet; Allerdings hemmte Zidovudin das E. coli-Wachstum bei 0,1 μg/ml deutlich (Abb. 1). Bei mehreren antiviralen Mitteln mit antibakterieller Aktivität gegen E. coli wurde innerhalb von 4 Stunden nach der Exposition eine Wachstumshemmung beobachtet, die sich in einer signifikanten Verringerung der optischen Dichte (OD) äußerte, und alle antiviralen Mittel mit antibakterieller Aktivität hemmten das Wachstum innerhalb von 8 Stunden (Abb. 1). In einigen Fällen blieb die Bedeutung der antimikrobiellen Wirkung über die Zeit erhalten, während sie sich in anderen Fällen im Laufe der Zeit veränderte, entweder zunahm oder abnahm (Abb. 1). Wir gingen konservativ mit dem um, was wir als signifikante Wachstumshemmung betrachteten, und wir forderten sowohl eine signifikante (p < 0,005) als auch eine erhebliche (>10 %) Reduktion des Wachstums der antiviral behandelten Bakterien im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (Supplementary Data 3, Supplementary Abb . 2). Unterschiede wurden als signifikant eingestuft, wenn der p-Wert des t-Tests den Schwellenwert erreichte (p < 0,005). Alle signifikanten Unterschiede wurden zu Vergleichszwecken weiter nach ihrem Signifikanzgrad differenziert (von der größten zur geringsten Signifikanz: p < 0,00005, p < 0,0005, p < 0,005). Ergebnisse, die nicht signifikant waren, wurden als kein signifikanter Wachstumsunterschied zwischen der mit Medikamenten behandelten Erkrankung und der unbehandelten Erkrankung interpretiert.

a Antibakterielle Wirkung antiviraler Medikamente nach 4–24-stündiger Exposition bei verschiedenen antiviralen Konzentrationen im Bereich von 0,1–100 μg/ml. Die Nukleosidanaloga Aciclovir, Didanosin, Lamivudin, Stavudin und Zidovudin beeinflussen nur das Wachstum von E. coli. Sowohl E. coli als auch B. cereus werden durch den nicht-nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitor Efavirenz und die Integrase-Inhibitoren Dolutegravir und Raltegravir in Konzentrationen von 10–100 μg/ml ab deutlich gehemmt (mit einer Wachstumsreduktion von mindestens 10 % im Vergleich zur Kontrolle). 4 Stunden Expositionszeit für E. coli und 8 Stunden für B. cereus. b Beispiel für Wachstumskurven von E. coli, behandelt mit 0,1–100 μg/ml Aciclovir über 24 Stunden. Der signifikanteste Wachstumsunterschied, wie er in der Wachstumskurve beobachtet und in der Wärmekarte (a) vermerkt ist, beträgt nur 8–24 Stunden mit 100 μg/ml Aciclovir. c Beispiel für Wachstumskurven von E. coli, behandelt mit 0,1–100 μg/ml Zidovudin über 24 Stunden. Signifikante Unterschiede zwischen unbehandelten und mit Zidovudin behandelten E. coli sind bei allen getesteten Konzentrationen und über alle Zeitpunkte von 4 bis 24 Stunden zu beobachten.

Nachdem wir gezeigt hatten, dass acht der getesteten Virostatika signifikante antibakterielle Wirkungen auf das Wachstum von E. coli hatten und drei das Wachstum von B. cereus beeinflussten, untersuchten wir das Potenzial von Bakterien, bei wiederholter Exposition gegenüber den antibakteriellen Wirkungen dieser Virostatika resistent zu werden untersuchtes Medikament. Zu den antiviralresistenten Stämmen, die isoliert wurden, gehörten Zidovudin-resistente, Lamivudin-resistente, Stavudin-resistente und Didanosin-resistente E. coli. Sowohl für E. coli als auch für B. cereus wurden Dolutegravir-resistente und Raltegravir-resistente Stämme isoliert. Resistente Stämme erzielten im Vergleich zum Wildtyp ein ähnliches maximales Wachstum und eine ähnliche Wachstumskinetik, mit Ausnahme des zidovudinresistenten E. coli-Stamms, der im Vergleich zum Wildtyp ein um 32 % geringeres maximales Wachstum erzielte (Ergänzende Daten 4; Ergänzende Abbildung 3). Während der Inkubationszeit von 4–12 Stunden, während sich die Bakterien in der logarithmischen Phase befanden und die OD schnell anstieg, zeigten Wildtyp-B. cereus und die antiviralresistenten Stämme einen durchschnittlichen Anstieg der OD von 0,162 (Absorption, 600 nm) pro Stunde zeigte einen Anstieg von 0,154 pro Stunde. Wildtyp-E. coli zeigte einen OD-Anstieg von 0,162 pro Stunde und antiviralresistente Stämme (mit Ausnahme von Zidovudin-resistenten E. coli) zeigten einen durchschnittlichen OD-Anstieg von 0,199 pro Stunde (Supplementary Data 4). Eine Resistenz gegen antivirale Medikamente wurde bei subhemmenden Konzentrationen beobachtet, typischerweise bei <100 μg/ml (Ergänzende Daten 5; Ergänzende Abb. 4). Bei Efavirenz-Behandlungen wurde weder bei E. coli noch bei B. cereus eine Resistenz beobachtet; Bei E. coli-Aciclovir-Behandlungen wurde eine Resistenz beobachtet, es wurde jedoch kein resistenter Stamm isoliert (Supplementary Data 5).

Die Resistenz gegen ein antivirales Medikament führte bei allen sechs E. coli zu einer Kreuzresistenz mit anderen antiviralen Medikamenten, und es entwickelten sich beide B. cereus-resistenten Stämme (Abb. 2, Ergänzende Daten 6). Obwohl jeder Stamm ein einzigartiges Kreuzresistenzmuster mit anderen antiviralen Mitteln aufwies, gruppierten sich die Kreuzresistenzprofile in einigen Fällen nach der antiviralen Klasse, aus der jeder Stamm isoliert wurde (ergänzende Abbildung 5). Beispielsweise waren E. coli-Mutanten, die aus den NRTI-Behandlungen Lamivudin und Stavudin isoliert wurden, kreuzresistent gegenüber den NRTIs Lamivudin, Stavudin und Didanosin, aber anfällig gegenüber Zidovudin (NRTI), Dolutegravir (II) und Efavirenz (NNRTI). Diese Stämme gruppierten sich und ähnelten auch dem Didanosin-resistenten NRTI-Stamm (dessen Profil eher dem Wildtyp-E. coli ähnelte als den Lamivudin- und Stavudin-resistenten Stämmen). Ebenso zeigten Stämme, die gegen die Integrasehemmer Dolutegravir und Raltegravir resistent waren, ähnliche Kreuzresistenzprofile und gruppierten sich. Diese Stämme zeichneten sich durch eine breitere Kreuzresistenz als die NRTI-resistenten Stämme aus und waren gegen alle getesteten Virostatika außer Zidovudin resistent. Obwohl es sich bei dem Zidovudin-resistenten E. coli-Stamm um einen NRTI wie Lamivudin, Stavudin und Didanosin handelte, wies er ein einzigartig breites Kreuzresistenzprofil auf, das den Resistenzprofilen der Integrase-Inhibitor-resistenten Stämme ähnlicher war, sich jedoch auf einzigartige Weise von diesen abhob. Zidovudin-resistenter E. coli war der einzige Nukleosidanalog-resistente Stamm, der eine Kreuzresistenz gegen NNRTI Efavirenz im Vergleich zum Wildtyp (40 % Wachstum im Vergleich zu 18 % Wachstum für Wildtyp-E. coli) sowie gegen Zidovudin selbst zeigte.

a Im Vergleich zu Wildtyp-E. coli zeigen die antiviralresistenten Stämme eine Kreuzresistenz mit mehreren antiviralen Mitteln, und es werden einzigartige Resistenzprofile für alle E. coli-Mutantenstämme beobachtet, die gegen NRTIs resistent sind (Didanosin-resistent, Didanosin-R; Lamivudin-resistent). , Lamivudin-R; Stavudin-resistent, Stavudin-R; Zidovudin-resistent, Zidovudin-R) und Integrase-Inhibitoren (Dolutegravir-resistent, Dolutegravir-R; Raltegravir-resistent, Raltegravir-R). b Dolutegravir-R- und Raltegravir-R-B.-cereus-Stämme sind im Vergleich zu Wildtyp-B.-cereus-Stämmen resistent gegen Efavirenz und Dolutegravir.

Isolierte E. coli- und B. cereus-Stämme, die gegen die Integrase-Inhibitoren Dolutegravir und Raltegravir resistent sind, zeigten Ähnlichkeiten in ihrer Kreuzresistenz mit Efavirenz, Dolutegravir und Raltegravir (Abb. 2a, b). Raltegravir-resistente B. cereus waren im Vergleich zu Wildtyp-B. cereus resistent gegen Efavirenz (93 % Wachstum gegenüber 9 % Wachstum). Interessanterweise zeigte der Raltegravir-resistente B. cereus-Mutantenstamm eine größere Resistenz gegen Dolutegravir im Vergleich zum „Dolutegravir-resistenten Stamm“, der in Gegenwart von Dolutegravir entwickelt und für Kreuzresistenztests isoliert wurde (Abb. 2b). Es wurde insgesamt gezeigt, dass antiviralresistente Stämme über 15 Passagen hinweg stabile Resistenzphänotypen aufwiesen. Beispielsweise behielt Dolutegravir-resistenter B. cereus während der gesamten Passage in Abwesenheit von Dolutegravir eine Resistenz gegen Raltegravir, Dolutegravir und Efavirenz bei; Zidovudin-resistente E. coli behielten über 15 Passagen hinweg ihre Resistenz gegen Zidovudin in Abwesenheit von Zidovudin (Supplementary Data 7).

Wir haben das Ausmaß der erworbenen Resistenz bei E. coli und B. cereus weiter untersucht, indem wir die isolierten antiviralresistenten Stämme mit zehn häufig verschriebenen Breitbandantibiotika herausgefordert haben (Supplementary Data 8). Die endgültigen Antibiotikakonzentrationen, die zur Bekämpfung von Wildtyp- und mutierten E. coli- und B. cereus-Stämmen verwendet wurden, wurden ausgewählt, nachdem zunächst jeder einzelne Stamm herausgefordert und dann eine Konzentration ausgewählt wurde, die den Bereich der Reaktion auf Arzneimittel – d. h. Wachstumsveränderungen – im gesamten Wildtyp erfasst und antivirenresistente Mutantenstämme zur vergleichenden Analyse. Ähnlich wie ihre Kreuzresistenzen mit anderen antiviralen Mitteln zeigten antiviralresistente E. coli- und B. cereus-Stämme jeweils einzigartige Resistenz-/Anfälligkeitsmuster gegenüber Antibiotika (Abb. 3, Abb. 4, siehe Ergänzende Daten 9 für Signifikanzbestimmungen). Einige Mutantenstämme zeigten eine starke Resistenz gegen Antibiotika, und einige Stämme waren im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle anfälliger für Antibiotika. E. coli- und B. cereus-Mutanten, die gegen dasselbe antivirale Mittel resistent waren, zeigten unterschiedliche Antibiotika-Kreuzresistenzen. Beispielsweise zeigten Dolutegravir-resistente E. coli eine gewisse Resistenz gegen Tetracyclin und Oxytetracyclin (Abb. 3), während Dolutegravir-resistente B. cereus im Vergleich zum Wildtyp anfälliger für Tetracyclin und Oxytetracyclin waren (Abb. 4).

Einige antiviralresistente E. coli-Mutanten sind jedoch anfälliger für einige Antibiotika als Wildtyp-E. coli, einschließlich einer erhöhten Anfälligkeit didanosinresistenter (Didanosin-R) E. coli gegenüber Amoxicillin und Gentamicin. Sternchen (*) zeigen einen signifikanten Unterschied im Vergleich zum Wildtyp an (p < 0,05 und mindestens 10 % erheblicher Wachstumsunterschied zwischen behandeltem Wildtyp und resistentem Stamm); Balken stellen Maximal-, Minimal- und Mittelwerte für n = 3 Absorptionsmessungen dar.

Allerdings waren die antiviralresistenten Mutanten von B. cereus, Raltegravir-resistent (Raltegravir-R) und Dolutegravir-resistent (Dolutegravir-R), im Vergleich zum Wildtyp von B. cereus häufig gleich oder anfälliger für Antibiotika, wie ihre Reaktion auf Oxytetracyclin zeigt Spectinomycin. Sternchen (*) zeigen einen signifikanten Unterschied im Vergleich zum Wildtyp an (p < 0,05 und mindestens 10 % erheblicher Wachstumsunterschied zwischen behandeltem Wildtyp und resistentem Stamm); Balken stellen Maximal-, Minimal- und Mittelwerte für n = 3 Absorptionsmessungen dar.

Die meisten antiviralresistenten E. coli-Mutantenstämme zeigten mehrere starke Antibiotika-Kreuzresistenzen. Raltegravir-resistente, Dolutegravir-resistente und Zidovudin-resistente E. coli zeigten Resistenzen gegen Clarithromycin und Erythromycin (Makrolid-Antibiotika) (Abb. 3). Zidovudin-resistente und Lamivudin-resistente E. coli waren resistent gegen Trimethoprim. Dolutegravir-resistente und Zidovudin-resistente E. coli-Stämme zeigten eine Kreuzresistenz gegenüber Tetracyclin. Im Vergleich zu Wildtyp-E. coli zeigten Dolutegravir-resistente E. coli auch eine geringere Anfälligkeit gegenüber Amoxicillin, Spectinomycin und Sulfamethoxazol (24 vs. 90 %, 54 vs. 77 %, 56 vs. 70 %, Wildtyp vs. Dolutegravir-resistentes Wachstum, bzw.) zusätzlich zu den Makrolid- und Tetracyclin-Antibiotika (Abb. 3, Ergänzende Daten 10). Einige antiviralresistente E. coli-Stämme waren im Vergleich zu Wildtyp-E. coli anfälliger für Antibiotika. Eine größere Anfälligkeit wurde bei Lamivudin- und Didanosin-resistenten E. coli gegenüber Amoxicillin und bei Raltegravir-resistenten E. coli gegenüber Oxytetracyclin beobachtet. Bei Behandlung mit Gentamicin (Aminoglykosid) waren sowohl Raltegravir-resistente als auch Zidovudin-resistente E. coli resistenter als Wildtyp-E. coli (46 % vs. 32 % Wachstum bei Raltegravir-resistenten und 92 % vs. 32 % bei Zidovudin-resistenten E. coli). resistente E. coli).

B. cereus-Raltegravir-resistente und Dolutegravir-resistente Stämme waren im Vergleich zum Wildtyp B. cereus gegenüber sieben von zehn getesteten Antibiotika entweder anfälliger oder vergleichbar anfällig. Sowohl Dolutegravir-resistente als auch Raltegravir-resistente B. cereus waren im Vergleich zum Wildtyp gleichermaßen anfällig für Amoxicillin und Sulfamethoxazol (Abb. 4). Die Stämme waren im Vergleich zum Wildtyp B. cereus anfälliger für Spectinomycin, Tetracyclin, Trimethoprim, Oxytetracyclin und Chloramphenicol (Abb. 4). Bei den Antibiotika Gentamicin, Erythromycin und Clarithromycin zeigten die antiviralresistenten Stämme jedoch eine größere Resistenz im Vergleich zum Wildtyp B. cereus: Nur Dolutegravir-resistenter B. cereus war resistent gegen Gentamicin; Ähnlich wie Dolutegravir-resistente und Raltegravir-resistente E. coli waren Dolutegravir-resistente und Raltegravir-resistente B. cereus beide resistent gegen Clarithromycin und Erythromycin. Bei Behandlung mit 1 μg/ml Erythromycin zeigte Wildtyp-B. cereus im Vergleich zum unbehandelten Wildtyp im Durchschnitt nur ein Wachstum von 7 %, während Dolutegravir-resistenter B. cereus im Vergleich zu unbehandeltem Dolutegravir-resistentem B. cereus ein Wachstum von 90 % aufwies. Raltegravir-resistenter B. cereus zeigte in Gegenwart von Erythromycin ein Wachstum von 76 % im Vergleich zu unbehandeltem Raltegravir-resistentem B. cereus. Bei Exposition gegenüber 0,1 μg/ml Clarithromycin zeigte Wildtyp B. cereus ein Wachstum von 9 %, während Dolutegravir-resistente und Raltegravir-resistente Stämme ein Wachstum von 103 % bzw. 75 % zeigten.

Nachdem unsere Ergebnisse zeigten, dass antiviral resistente E. coli eine breite Kreuzresistenz gegen Antibiotika aufweisen können, wollten wir die klinische Relevanz des Überlebens und Wachstums antiviral resistenter E. coli kontextualisieren. Um die Antibiotika-Kreuzresistenz-Phänotypen der antiviralresistenten Stämme und die In-vitro-Methode zur Resistenzbewertung zu validieren, haben wir einen gut charakterisierten multiresistenten E. coli-Stamm (ATCC BAA-2471, klinische Atemwegsprobe) damit getestet Antibiotika und Konzentrationen, die zur Bekämpfung antivirenresistenter E. coli-Stämme eingesetzt werden. E. coli BAA-2471 weist Resistenzen gegen viele Klassen von Antibiotika auf, darunter Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme, Chinolone, Aminoglykoside und andere29. Der Stamm ist daher resistent gegen die von uns getesteten Antibiotika, darunter Amoxicillin, Gentamicin, Tetracyclin, Trimethoprim und Sulfamethoxazol. Mit unseren Methoden haben wir die Resistenz von BAA-2471 gegenüber diesen Antibiotika bestätigt und auch die Resistenz oder Anfälligkeit des Stammes gegenüber antiviralen Medikamenten verglichen (Abb. 5, Ergänzende Daten 11). Zidovudin-resistente E. coli – der antiviralresistente E. coli-Stamm mit dem breitesten Resistenzprofil – und unbehandeltes BAA-2471 zeigten eine vergleichbare Wachstumskinetik. Tatsächlich wurde bei allen Antibiotika, gegen die BAA-2471 angeblich resistent war, eine Resistenz beobachtet, und das Wachstum von BAA-2471 und Zidovudin-resistenten E. coli in Gegenwart einer Antibiotikabehandlung war vergleichbar (Abb. 5, Ergänzende Daten 15). Während sowohl BAA-2471 als auch Zidovudin-resistente E. coli in Gegenwart von 3 μg/ml Gentamicin Wachstum zeigten, stellten wir in unseren Tests fest, dass das Wachstum von BAA-2471 bei 16-stündiger Inkubation mit 5 μg/ml Gentamicin gehemmt wurde, wohingegen das Wachstum von BAA-2471 Zidovudin-resistent war E. coli war nicht anfällig (Abb. 3, Ergänzende Daten 11). In Gegenwart von 50 μg/ml Zidovudin zeigten Zidovudin-resistente E. coli nach 16-stündiger Inkubation ein Wachstum von 120 % im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, während BAA-2471 nur ein Wachstum von 48 % aufwies (Abb. 5, Ergänzende Daten 15). Diese Ergebnisse bestätigten unseren Ansatz zur Beurteilung der phänotypischen Resistenzprofile resistenter Stämme und ermöglichten eine vergleichende Analyse des Bakterienwachstums in Gegenwart und Abwesenheit antiviraler Medikamente und Antibiotika unter Verwendung eines gut charakterisierten resistenten klinischen Isolats.

Wie erwartet ist das multiresistente klinische E. coli-Isolat BAA-2471 in den getesteten Konzentrationen resistent gegen Amoxicillin und Tetracyclin, während Wildtyp-E. coli bei diesen Konzentrationen anfällig waren (Wildtyp-Reaktion in Abb. 3 dargestellt). Die Wachstumskurven von Zidovudin-resistenten E. coli (AZT-R) zeigen die gleiche Resistenz wie BAA-2471 gegenüber den Antibiotika sowie dem antiviralen Dolutegravir. Allerdings ist BAA-2471 anfällig für Zidovudin. Für jeden Zeitpunkt n = 3 technische Replikate; Für jeden Zeitpunkt wird die mittlere Extinktion aufgetragen, und das Fehlen beobachtbarer Fehlerbalken an irgendeinem Datenpunkt weist auf eine enge Übereinstimmung der dreifachen Messungen hin.

Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Zidovudin-resistente E. coli Resistenzmutationen aufweisen, die im Vergleich zum klinischen Isolat BAA-2471 einzigartig sind, jedoch eine vergleichbare Fitness in Abwesenheit des Arzneimittels und ein vergleichbares Überleben in Gegenwart von Antibiotikakonzentrationen gewährleisten, die den Wildtyp hemmen .

Nachdem wir beobachtet hatten, dass antivirenresistente Isolate von E. coli und B. cereus im Vergleich zum Wildtyp phänotypisch einzigartige Veränderungen in der Antibiotikaresistenz aufweisen, führten wir eine Gesamtgenomsequenzierung antivirenresistenter E. coli-Stämme durch, um genetische Veränderungen zu identifizieren, die dazu führen können Erklären Sie die Resistenz gegen antivirale Medikamente oder Antibiotika. Eine vergleichende Genomanalyse von B. cereus-Isolaten konnte aufgrund der Kontamination während der Vorbereitung der Referenzstammbibliothek und der geringen Anzahl mutierter Stämme nicht durchgeführt werden. Insgesamt gab es im Vergleich zum Referenzstamm nur zwei und bis zu 23 einzigartige genetische Veränderungen in den antiviralresistenten E. coli-Mutantengenomen, die weder auf eine Änderung der Referenz während der Sequenzierung zurückgeführt werden konnten (Unterschiede gefunden in aller mutierten Genome) oder auf einen Sequenzierungsfehler zurückzuführen (z. B. Einfügung von A in die A-Homopolymersequenz) (Supplementary Data 13). Mutationen, die in drei der mutierten Stämme beobachtet wurden (Raltegravir-resistenter E. coli, [CP117043]; Dolutegravir-resistenter E. coli, [CP117044]; Didanosin-resistenter E. coli, [CP115968]; Abb. 6, Abb. 7) hatte genetische Veränderungen in Genen mit nachgewiesener Rolle bei der Antibiotikaresistenz. Raltegravir-resistente und Dolutegravir-resistente E. coli-Isolate – beides Integrase-Inhibitor-resistente Stämme – weisen die gleiche Basenveränderung (A→G) auf, die zu einer nicht-synonymen Aminosäureveränderung (Y→C) im cAMP-aktivierten globalen Transkriptionsregulator führt crp (Abb. 7), assoziiert mit Resistenz gegen Makrolide, was möglicherweise einen Teil ihres erworbenen Antibiotikaresistenzphänotyps dieser beiden antiviralen Medikamente aus derselben antiviralen Klasse erklärt. Im Dolutegravir-resistenten E. coli-Isolat wurde eine Mutation in der Multidrug-Effluxpumpe, der Efflux Resistance-Nodulation-Division (RND) Transporterpermease acrB, beobachtet. In diesem Fall führte die beobachtete Mutation zu einer Verlängerung des Proteins um 1,8 % (Abb. 7) und könnte die beobachtete Resistenz gegen Tetracyclin erklären30,31,32,33. In Didanosin-resistenten E. coli wurde eine Deletion in der ABC-Transporterpermease yhdY (Deletion eines einzelnen Basenpaars im Codon 232) beobachtet, was auf eine möglicherweise veränderte Funktion dieser Proteinfamilie hindeutet, die am Transport einer Vielzahl von Substituenten beteiligt ist, darunter nicht nur Kohlenhydrate, sondern auch Proteine und Lipide, aber auch Arzneimittel34 (Abb. 6). Das durch die Deletion einzelner Basenpaare eingeführte frühe Stoppcodon führte zu einer Reduzierung der Proteinlänge um 35,2 %. Darüber hinaus wiesen zwei Mutanten, die Nukleosidanaloga ausgesetzt waren (Lamivudin-resistenter E. coli, [CP115179], Cytidin-Analogon; Zidovudin-resistenter E. coli, [CP117469], Thymidin-Analogon), unterschiedliche genetische Veränderungen im Thymidinkinase-Gen (tdk) auf, was darauf hindeutet eine Rolle bei der Resistenz gegen antivirale Arzneimittel gegen Nukleosidanaloga (Supplementary Data 13).

Blaue Hervorhebung weist auf eine bekannte Rolle bei der antimikrobiellen Resistenz hin; Die grüne Hervorhebung weist auf eine kürzlich vermutete Rolle bei der Resistenz hin. +Zugangsnummer unter jedem Genom aufgeführt. *In der Spalte „Mutation“ wird zunächst in Klammern die Codon-Nummer im Wildtyp-Referenzgen aufgeführt, die im Vergleich zum antiviralresistenten Stamm mutiert ist, gefolgt von der Mutation, die als Aminosäureabkürzung mit einem Buchstaben und der Sequenz des Wildtyps und des einzelnen beschrieben wird Buchstaben-Aminosäureabkürzung und veränderte Sequenz im mutierten Gen für antivirale Resistenz.

Andere Mutationen, die erhebliche Veränderungen in den Proteinsequenzen verursachen, die in antivirenresistenten E. coli beobachtet wurden, wurden in neueren Studien in Genen lokalisiert, die an der Antibiotikaresistenz beteiligt sind. Beispielsweise wurden Mutationen in der kodierenden Region für die N-Acetylgalactosamin-spezifische Transporteruntereinheit IIB (agaV) des Phosphotransferasesystems (PTS) in Dolutegravir-resistenten E. coli beobachtet. Dieses System ist am Kohlenhydrattransport beteiligt, doch Mutationen im PTS wurden auch mit einer Pantoleranz gegenüber antimikrobiellen Mitteln in Verbindung gebracht26 (Abb. 7). Die Mutation in agaV führte zu einer Verkürzung der Proteinlänge um 47,6 %. Außerdem wurde in Dolutegravir-resistenten E. coli eine Insertion von fünf Basenpaaren in der sensorischen Domäne des Proteins der Zweikomponenten-Sensorkinase-Familie beobachtet, das aus einer Histidinkinase und einem zugehörigen Reaktionsregulator besteht. Verschiedene Mutationen in dieser Proteinfamilie wurden mit antimikrobieller Resistenz in Verbindung gebracht35. Lamivudin-resistente E. coli zeigten eine Deletion eines einzelnen Basenpaars in der Region, die für Hexose-6-phosphat:Phosphat-Antiporter (uhpT) kodiert, was zu einer Verkürzung des Proteins um 73,1 % führte (Abb. 6). Dieser Antiporter ist am Austausch von Hexose-6-Phosphat (zu dem die Zucker mit sechs Kohlenstoffatomen Glucose-6-Phosphat, Fructose-6-Phosphat und Mannose-6-Phosphat gehören könnten) und Phosphat über die Zellmembran hinweg beteiligt, und das hat er auch wurden auch mit Antibiotikaresistenzen in Verbindung gebracht36. Bei der tRNA1Val (Adenin37-N6)-Methyltransferase in Stavudin-resistenten E. coli wurde eine Deletion einzelner Basenpaare beobachtet, die zur Verkürzung von 52 % des Proteins führte (Abb. 6). Diese spezielle Methyltransferase methyliert Adenin an Position 37 von tRNA1 (Val). Didanosinresistente E. coli zeigten außerdem vier Deletionen einzelner Basenpaare im Codon 50 des Galactofuranose-bindenden Proteins (ytfQ), einem ABC-Transporter, der am Galactofuranose-Transport beteiligt ist, typischerweise unter Kohlenstoff-Fänger-Bedingungen, aber kürzlich als prädiktives Gen für antimikrobielle Resistenz37 (Abb. 6). ). Der Natrium/Glutamat-Symporter besaß eine einzelne Basenpaarinsertion, die zur Verkürzung von zehn Prozent des Proteins in Dolutegravir-resistenten E. coli führte. Obwohl noch mehr Arbeit erforderlich ist, um zu bestimmen, welche der in den mutierten Genomen beobachteten genetischen Veränderungen für die erworbenen antiviralen oder antimikrobiellen Phänotypen wichtig sind, haben wir mehrere wahrscheinliche Kandidaten vorgestellt, die eine bekannte Rolle bei der Antibiotikaresistenz spielen und zu den größten Veränderungen geführt haben Proteinsequenzen.

Um zu untersuchen, ob die Mutationen, die möglicherweise mit antiviraler Resistenz und Antibiotika-Kreuzresistenz verbunden sind, in einem charakterisierten multiresistenten E. coli-Modell beobachtet werden konnten, untersuchten wir die öffentlich verfügbare vollständige Genomsequenz für BAA-2471. Beim Vergleich von multiresistenten E. coli BAA-2471 mit antivirenresistenten E. coli-Stämmen wurde bei BAA-2471 keine der bei antivirenresistenten E. coli-Stämmen beobachteten Mutationen beobachtet, die zu einer Proteinverkürzung führten (Supplementary Data 14). Beispielsweise wurden die Mutationen in der Thymidinkinase und der bifunktionalen Aspartatkinase/Homoserindehydrogenase, die Zidovudin-resistente E. coli charakterisierten, in BAA-2471 nicht beobachtet. Alle Gene, die Insertionen oder Deletionen in antivirenresistenten E. coli-Mutanten enthielten, waren für BAA-2471 intakt und mit Wildtyp-E. coli vergleichbar.

Trotz der zunehmenden Bedenken der öffentlichen Gesundheit hinsichtlich der Entwicklung und Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen sind die über Antibiotika hinausgehenden Wirkstoffe, die zur Resistenzentwicklung beitragen, nach wie vor unvollständig geklärt21,38,39,40,41,42. Die Bemühungen zur Bekämpfung der Antibiotikaresistenz konzentrieren sich in erster Linie auf die Antibiotika-Verwaltung bei der Verschreibung von Antibiotika43, berücksichtigen jedoch nicht andere Medikamente mit antimikrobiellen Eigenschaften. Virostatika sind weltweit weit verbreitet, haben antibakterielle Wirkungen und werden sogar als Behandlung arzneimittelresistenter bakterieller Infektionen in Betracht gezogen13,15. Bisher sind uns keine Studien bekannt, die das Potenzial antiviraler Medikamente untersucht haben, zur antimikrobiellen Resistenz beizutragen. In dieser Arbeit untersuchten wir die antibakterielle Aktivität von vierzehn antiviralen Medikamenten verschiedener antiviraler Klassen, um ihr Potenzial zu bestimmen, zur antiviralen Resistenz und Antibiotika-Kreuzresistenz beizutragen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass neben Antibiotika auch antivirale Medikamente mit antibakteriellen Eigenschaften zur Antibiotikaresistenzbelastung beitragen können.

Gram-negative E. coli und gram-positive B. cereus wurden als gut charakterisierte Modellorganismen für Untersuchungen mit Umwelt- und klinischer Relevanz ausgewählt44,45,46. Virostatika wurden in Konzentrationen von 0,1–100 μg/ml über 0–24 Stunden getestet (Abb. 1). Der getestete Konzentrationsbereich umfasst hemmende und subhemmende Konzentrationen, die in früheren In-vitro-Tests mit Bakterien nachgewiesen wurden10,11,12. Wir haben in der vorhandenen Literatur getestete Konzentrationen einbezogen, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen und unsere Methoden zu validieren. Der getestete Konzentrationsbereich umfasst auch therapeutische oder zirkulierende Konzentrationen antiviraler Arzneimittel, wie die Plasmakonzentration von Zidovudin (0,016–1,7 mg/L)47 und das therapeutische Fenster von Efavirenz (1–4 mg/L)48 sowie Konzentrationen von In der aquatischen Umwelt nachgewiesene Virostatika, die Konzentrationen im μg/L-Bereich erreichen können49. Bei dem Versuch, Hemmwerte für verschiedene Inkubationszeiten und Expositionskonzentrationen zu ermitteln, lagen die getesteten Konzentrationsbereiche jedoch im Allgemeinen über den in der Umwelt nachgewiesenen Werten oder einer typischen Plasmakonzentration im menschlichen Körper50.

Wir haben erfolgreich antiviralresistente E. coli- und B. cereus-Mutanten isoliert, nachdem wir die Bakterien wiederholt antiviralen Medikamenten mit nachgewiesenen antibakteriellen Eigenschaften ausgesetzt hatten. Wenn antiviral-resistente Stämme mit Antibiotika und anderen antiviralen Arzneimitteln in Kontakt gebracht wurden, zeigte jeder resistente Stamm ein einzigartiges phänotypisches Resistenzprofil gegenüber antiviralen und antibiotischen Arzneimitteln. Die Resistenz- und Kreuzresistenzprofile der antiviralresistenten Stämme schienen zwar nach Klasse der antiviralen Arzneimittel zu gruppieren, aber keiner wies eine identische phänotypische Resistenz auf. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die antiviralen Medikamente trotz struktureller Ähnlichkeit aufgrund der Medikamentenklasse in einigen Fällen möglicherweise über unterschiedliche und möglicherweise mehrere Wege wirken, um ihre antibakteriellen Eigenschaften auszuüben. Resistente Mutanten können daher über einen einzigartigen Mutationssatz verfügen, der Resistenzen gegen antivirale Medikamente und Antibiotika verleiht.

In einigen Fällen führten antivirale Resistenzmutationen zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber einigen Antibiotika, wenn resistente Stämme einem Test auf Kreuzresistenz unterzogen wurden. Allerdings ist die erhöhte Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Antibiotikaklassen beispielsweise bei Dolutegravir- und Raltegravir-resistenten B. cereus-Stämmen möglicherweise nicht überraschend, wenn man sie zusammen mit den Ergebnissen anderer Studien betrachtet, in denen eine erhöhte Empfindlichkeit bestimmter arzneimittelresistenter Stämme beobachtet wurde Bakterien auf andere Klassen von Antibiotika28,51. Fitnesskosten und andere Veränderungen der Anfälligkeit aufgrund von Resistenzmutationen wurden auch an anderer Stelle beschrieben39,52,53. Das verringerte maximale Wachstum von Zidovudin-resistenten E. coli im Vergleich zum Wildtyp (Supplementary Data 4) und ein vergleichbares Wachstum mit multiresistentem BAA-2471 (Abb. 5) könnten darauf hindeuten, dass die bei diesem resistenten Stamm beobachteten Mutationen metabolische Kosten verursachen zum Mikroorganismus. Die Stabilität der Mutationen während der gesamten Passage, selbst in Abwesenheit des Arzneimittels, lässt jedoch darauf schließen, dass die Mutation günstig aufrechtzuerhalten oder nur schwer rückgängig zu machen ist54 (Ergänzende Daten 7). Weitere Untersuchungen könnten dabei helfen, aufzuklären, wo und wie die antimikrobiellen Medikamente ihren antimikrobiellen Einfluss auf die Zellreplikation oder den Stoffwechsel ausüben und wie sich Wachstumsbedingungen auch auf die Wirkung antimikrobieller Medikamente auf Bakterien auswirken55. Das Signifikanzniveau der antimikrobiellen Wirkung könnte darauf hindeuten, dass einige Medikamente früh bei der Zelltötung wirken, während andere erst nach längerer Inkubation wirksam werden.

Die Ergebnisse der Sequenzierung des gesamten Genoms lieferten weitere Beweise dafür, dass jeder antiviral resistente E. coli-Stamm einzigartige Mutationen aufwies, die eine Kreuzresistenz gegen verschiedene Klassen antiviraler Medikamente oder Antibiotika verliehen. Mutationen bestanden hauptsächlich aus Insertionen und Deletionen einzelner Basenpaare. Während die Ergebnisse der Gesamtgenomsequenzierung die phänotypischen Resistenzprofile ohne weitere eingehende biologische Untersuchungen nicht direkt erklären können, weisen die Ergebnisse auf Pfade und Ziele hin, die an der durch die Exposition gegenüber antiviralen Arzneimitteln verursachten Resistenz beteiligt sein könnten. Zwei der sechs E. coli-Isolate mit einer Mutation im selben Gen (Thymidinkinase-Gen tdk) legen nahe, dass ein veränderter Nukleosidstoffwechsel ein wichtiger Mechanismus zum Schutz vor der antimikrobiellen Wirkung von Nukleosidanaloga sein könnte. Thymidinkinase phosphoryliert Thymidin und Desoxyuridin, die beide an zahlreichen Stoffwechselwegen in E. coli beteiligt sind56,57.

Zwei der sechs E. coli-Isolate wiesen auch die gleiche genetische Veränderung in einem globalen Transkriptionsregulator auf, was ebenfalls darauf hindeutet, dass die Genregulation eine wichtige Rolle spielen könnte. Bemerkenswert war auch die beobachtete Mutation in der tRNA1Val (Adenin37-N6)-Methyltransferase in Stavudin-resistenten E. coli. Neuere Studien haben auf die Rolle von tRNA-Modifikationsgenen bei der Resistenz gegen zahlreiche Antibiotikaklassen hingewiesen58,59. Schließlich wurden Mutationen in mehreren Transportern identifiziert – darunter die ABC-Transporter-Permease yhdY, der PTS-N-Acetylgalactosamin-spezifische Transporter agaV, der Hexose-6-Phosphat:Phosphat-Antiporter uhpT und das ABC-Transporter-Galactofuranose-bindende Protein ytfQ –, die zu dem wichtigen beitragen Rolle von Membranprozessen bei Antibiotikaresistenzmechanismen.

Obwohl mehrere der beobachteten genetischen Mutationen in antiviralresistenten Isolaten in Proteinen oder Signalwegen auftraten, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie eine Rolle bei der Antibiotikaresistenz spielen, traten die meisten genetischen Veränderungen in Genen auf, von denen nicht bekannt ist, dass sie an der Antibiotikaresistenz beteiligt sind. Interessanterweise ist bekannt, dass viele der Gene, in denen die Mutationen auftraten, an Aspekten des Stoffwechsels und des Nährstofftransports beteiligt sind, wie z. B. Galactofuranose-bindendes Protein, Natrium-/Glutamattransporter und bifunktionale Aspartatkinase/Homoserindehydrogenase I. Dies steht im Einklang mit der vorhandenen Literatur deuten darauf hin, dass eine Reihe von Stoffwechselwegen an der Antibiotikaresistenz beteiligt sein könnten oder Angriffspunkte für neuartige Therapien gegen multiresistente bakterielle Infektionen darstellen könnten26,35,60,61,62, diese Mutationen könnten immer noch auf Schlüsselgene hinweisen, die an der Resistenz gegen antivirale Medikamente beteiligt sind und damit verbunden sind Antibiotika-Kreuzresistenz. Viele Gene, die über diejenigen hinausgehen, von denen traditionell angenommen wird, dass sie für die Antibiotikaresistenz verantwortlich sind, wurden als relevant für klinische Isolate mit Antibiotikaresistenz hervorgehoben, wie etwa Mutationen in N-Acetylglycosaim-Deacetylase63, Glycerinkinase27, Glycosytransferase64, Serin-Threonin-Kinase65 und Histidinkinase66. Angesichts des Interesses an der Identifizierung von Mutationen, die für den Resistenzphänotyp ursächlich sein könnten, könnten Mutationen in Genen wie die in dieser Studie identifizierten darauf hinweisen, dass nicht-antibiotische Arzneimittel möglicherweise dennoch antimikrobielle Wirkungen haben und von wo aus eine breite antimikrobielle Resistenz entstehen kann. Darüber hinaus könnten die in dieser Studie identifizierten Gene auf Signalwege hinweisen, die an der Resistenz beteiligt sein könnten und daher als Angriffspunkte für neuartige Therapeutika über herkömmliche Antibiotika hinaus dienen. Die in antiviralresistenten Genomen identifizierten Mutationen könnten zur Erklärung von Antibiotika-Kreuzresistenzphänotypen aufgrund antiviraler Exposition beitragen. Die identifizierten Mutationen könnten auch ein weiterer Beleg dafür sein, dass Mutationen in Genen, die über herkömmliche Resistenzgene hinausgehen, mit einer Reihe antimikrobieller Resistenzen in Zusammenhang stehen könnten.

Antivirenresistente E. coli zeigten eine phänotypische Resistenz über viele Klassen strukturell unterschiedlicher antimikrobieller Mittel hinweg, doch die Ergebnisse der Sequenzierung des gesamten Genoms von antivirenresistenten E. coli zeigten im Vergleich zu Wildtyp-E. coli relativ wenige Basenpaarmutationen. Daher können diese wenigen ausgewählten Mutationen weitreichende Auswirkungen auf eine breite Kreuzresistenz haben. Die meisten antiviralresistenten Stämme zeigten im Vergleich zum Wildtyp weniger als zehn einzigartige genetische Veränderungen. Beispielsweise zeigten Zidovudin-resistente E. coli bei weitem das breiteste phänotypische Resistenzprofil gegen alle getesteten antiviralen und antibiotischen Arzneimittel, wiesen jedoch nur zwei einzigartige genomische Mutationen in kodierenden Regionen auf: im Thymidinkinase-Gen und in der bifunktionellen Aspartatkinase/Homoserindehydrogenase I. Andere Studien haben einen Zidovudin-resistenten Phänotyp mit Mutationen in der Thymidinkinase in Verbindung gebracht9,67,68. Doléans-Jordheim et al. untersuchten nur spontane Zidovudin-resistente Mutanten – und nicht Mutanten, die nach wiederholter Zidovudin-Exposition isoliert wurden – und die genetische Analyse beschränkte sich nur auf das Thymidinkinase-Gen und nicht auf das gesamte Genom. Doléans-Jordheim et al. berichteten über keine Hinweise auf eine Antibiotika-Kreuzresistenz bei spontanen Zidovudin-resistenten Mutanten, es wurde jedoch die Stabilität der Zidovudin-Resistenz beobachtet, wie auch in unserer Studie. Es ist möglich, dass eine genetische Mutation, die über die Thymidinkinase hinausgeht, allein für die breite Kreuzresistenz verantwortlich ist, die in unseren Zidovudin-resistenten E. coli beobachtet wird, und dass eine wiederholte Exposition gegenüber dem Medikament auch notwendig ist, um Resistenzmutationen zu induzieren, die eine Kreuzresistenz mit anderen antimikrobiellen Mitteln verleihen. Nach unserem Kenntnisstand haben keine Studien untersucht, wie Mutationen in der bifunktionellen Aspartatkinase/Homoserindehydrogenase I in Verbindung mit Mutationen in der Thymidinkinase Kreuzresistenz oder Toleranz gegenüber mehreren Antibiotikaklassen verleihen. Sowohl die Thymidinkinase als auch die bifunktionelle Aspartatkinase/Homoserindehydrogenase I sind letztendlich am Nukleotidstoffwechsel beteiligt69 und insbesondere am Pyrimidin-Thymidin. Homoserindehydrogenase wurde kürzlich als Ziel bei systemischen Pilzinfektionen vorgeschlagen70. Da es sich bei Zidovudin um ein Analogon von Thymidin handelt, lässt sich die Hypothese aufstellen, dass ein Ziel von Zidovudin die Stoffwechselwege von Thymidin sein könnten, die auch die Resistenz von E. coli gegenüber einer Reihe von Antibiotika beeinflussen könnten. Trimethoprim und Sulfamethoxazol zielen insbesondere auf den Tetrahydrofolatstoffwechsel ab, der auch Thymidin und die Thymidinkinase betrifft71. In anderen Zusammenhängen wurde gezeigt, dass Zidovudin die Übertragung von Antibiotikaresistenzgenen durch horizontalen Gentransfer verhindert72. Unsere Studien liefern Hinweise darauf, dass sich chromosomale Mutationen, die eine Kreuzresistenz gegen das antivirale Mittel Zidovudin und eine naive Kreuzresistenz gegen Antibiotika verleihen, aufgrund der Anwesenheit des Expositionsmedikaments de novo entwickeln können. Die Fähigkeit von Bakterien, sich an Umweltstressoren, einschließlich Medikamente, anzupassen, kann zu vielen verschiedenen Veränderungen und Anpassungen für das Überleben führen73,74. Veränderungen in der Genfunktion können sowohl Mechanismen sein, um eine Umweltbelastung zu überstehen, als auch zu antimikrobieller Resistenz führen oder damit verbunden sein66,75,76. Antivirale Medikamente können ähnliche Wirkungen haben wie Stressfaktoren, die zu Resistenzphänotypen führen. Allerdings sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Wege und Mechanismen zu ermitteln, über die antivirale Medikamente Bakterien beeinflussen.

Abgesehen von der Exposition gegenüber oraler antiviraler Therapie und dem damit verbundenen Risiko der Entwicklung einer antimikrobiellen Resistenz im menschlichen Körper stellt das Vorhandensein von antiviralen Arzneimitteln und antiviralresistenten Bakterien aus menschlichen Abfällen in der aquatischen Umwelt ein Risiko für die Entwicklung und Ausbreitung einer antimikrobiellen Resistenz in der aquatischen Umwelt dar. Es können parallele Auswirkungen auf die Umwelt zwischen Antibiotika und antiviralen Arzneimitteln gezogen werden, um die Risiken antiviraler Arzneimittel in der Umwelt hervorzuheben. Antibiotika wie Amoxicillin, Erythromycin, Trimethoprim und Sulfamethoxazol werden häufig in Oberflächengewässern nachgewiesen und wurden mit dem Vorhandensein von Resistenzgenen in Verbindung gebracht77,78,79,80,81. Virostatika mit antibakteriellen Eigenschaften wurden auch in der aquatischen Umwelt nachgewiesen – vom Abwasser über Oberflächengewässer bis hin zum Trinkwasser82 – ihr Beitrag zur Entwicklung und Verbreitung von Resistenzgenen ist jedoch unbekannt. Aktuelle Abwasserbehandlungsverfahren entfernen viele antivirale Wirkstoffe oft nicht ausreichend aus dem Abwasser. Viele Virostatika verbleiben bei der Abwasserbehandlung83,84,85,86 und werden in Konzentrationen von ng/L bis μg/L nachweisbar in die Umwelt freigesetzt. Virostatika mit bekannten antibakteriellen Eigenschaften (z. B. Zidovudin und Efavirenz) wurden neben Abwasser auch in Böden, Oberflächenwasser und Trinkwasser nachgewiesen50,82,85,87,88. Das dokumentierte Vorkommen, die Persistenz und die chronisch niedrigen Konzentrationen antiviraler Mittel in der Umwelt sind ein ähnliches Szenario wie das Vorkommen von Antibiotika in der aquatischen Umwelt. Ähnlich wie bei Antibiotika könnte das Vorhandensein antibakterieller Virostatika in der Umwelt die Krise der antimikrobiellen Resistenz verschärfen, da sich antivirale Kreuzresistenzgene entwickeln und verbreiten. Der Nachweis antiviraler Medikamente in der Umwelt verdeutlicht das Risiko einer Exposition von Bakterien und Menschen gegenüber antiviralen Medikamenten über den Zusammenhang des Medikamentenkonsums hinaus.

Durch die Entwicklung und Isolierung neuartiger antiviralresistenter Mutantenstämme von E. coli und B. cereus haben wir gezeigt, wie nicht-antibiotische Medikamente wie antivirale Medikamente zur antimikrobiellen Resistenz beitragen können. Bakterien, die einzelnen antiviralen Medikamenten ausgesetzt waren, entwickelten stabile Mutationen, die zu einer Kreuzresistenz mit anderen antibakteriellen antiviralen Medikamenten und Antibiotika führten. Zukünftig wird die Isolierung und Prüfung einer großen Anzahl (>5) antiviral-resistenter Isolate aus jeder antiviralen Exposition helfen, die Frage zu beantworten, ob antivirale Resistenzmutationen konsistent oder stochastisch sind. Angesichts der Vielfalt grampositiver und gramnegativer Bakterien wird die Verwendung zusätzlicher E. coli-Stämme und die Ausweitung dieser Arbeit über E. coli und B. cereus hinaus dazu beitragen, die umfassenderen Auswirkungen auf die Wirkung antibakterieller Virostatika auf solche Bakteriengemeinschaften aufzuklären kommen in Umweltgewässern, Kläranlagen und im menschlichen Darm vor. Die Mechanismen der Resistenz gegen antivirale Medikamente variieren wahrscheinlich je nach Spezies und sogar Bakterienstamm, und die entstehenden Kreuzresistenzmuster können daher auch heterogen sein. Auch die Auswirkungen von Medikamentenmischungen – ähnlich wie sie im menschlichen Körper oder im sehr heterogenen Kontext von Abwasser relevant sind – auf Bakterien erfordern weitere Untersuchungen. Da die Verwendung und Herstellung antiviraler Medikamente weltweit weiter zunimmt, wird es von entscheidender Bedeutung sein, den potenziellen Beitrag antiviraler Medikamente zur antimikrobiellen Resistenz sowohl im menschlichen Körper als auch in der Umwelt voll auszuschöpfen. Das Risiko der Entwicklung einer antimikrobiellen Resistenz aufgrund des Vorhandenseins antiviraler Medikamente kann auch dort am höchsten sein, wo die Belastung durch Viruserkrankungen – und die gleichzeitige Einnahme antiviraler Medikamente – ebenfalls am höchsten ist. Der Mangel an Abwasserinfrastruktur dürfte das Risiko noch verstärken, da unbehandeltes Abwasser in die Umwelt gelangt und damit hohe Konzentrationen antiviraler Medikamente und Bakterien entstehen.

Alle antiviralen Verbindungen wurden von Toronto Research Chemicals gekauft und hatten eine zertifizierte Reinheit von >98 %. Basierend auf der Löslichkeit wurden Stammlösungen von 1, 2 oder 10 mg/ml in MilliQ-Wasser oder DMSO hergestellt und in bernsteinfarbenen Fläschchen bei 4 °C gelagert. Coli (Stamm B, Produktnummer 12-4300) wurde von Carolina gekauft. B. cereus wurde von Ward's Science (WARD470176-602) erworben. Multiresistente E. coli (Produktnummer BAA-2471) wurden von ATCC gekauft.

Bakterien wurden zunächst aus Agar-Schrägagar in autoklavierten Medien gezüchtet: LB-Medium, Lennox (Fisher, BP1427-500, Lot 188454) für E. coli B oder tryptische Sojabrühe (TSB)-Medium (Teknova, TO420, Lot T042010A2001) für B. cereus . Die Medien wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Nach dem Wachstum der Bakterien bis zur stationären Phase in sterilen belüfteten T25-Kolben wurden die Bakterien auf Agarplatten ausplattiert und einzelne Kolonien ausgewählt, um Glycerinvorräte (50 % Glycerin, 50 % Bakterien im Kulturmedium) für die zukünftige Verwendung während der Experimente vorzubereiten. Um resistente Stämme zu entwickeln, wurden in Flaschen gezüchtete Bakterien mit 10–100 μg/ml antiviralem Mittel über Nacht bei 37 °C inkubiert. Bakterien wurden durch einminütiges Zentrifugieren in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen bei 4000 U/min gesammelt. Die Bakterien wurden mit LB- oder TSB-Medium gewaschen, ein zweites Mal zentrifugiert, dann im Medium resuspendiert und in einen frischen Kolben mit insgesamt 5 ml frischem Medium und der gleichen antiviralen Konzentration wie zuvor gegeben. Die Bakterien wurden über Nacht bei 37 °C nachgezüchtet, dann auf einer Mikrotiterplatte mit einer anfänglichen optischen Dichte von 0,1 ausplattiert und mit einem antiviralen Mittel von 0,1–100 μg/ml (Supplementary Data 5) behandelt, um eine Resistenz sicherzustellen, die durch ungehemmtes Wachstum der Bakterien im antiviralen Mittel beobachtet wurde -behandelte Brunnen.

Multiresistente E. coli, die für Positivkontrollexperimente verwendet wurden (ATCC BAA-2471), wurden in Difco Nutrient Broth (BD-Katalognummer 234000) unter Zusatz von 25 μg/ml Imipenem (MedChemExpress-Katalognummer HY-B1369/CS-W019618) gezüchtet. Gemäß den Empfehlungen des Herstellers, um den Verlust des New Delhi Metallo-Beta-Lactamase (NDM)-Plasmids zu verhindern.

Das Bakterienwachstum – gemessen als optische Dichte (OD) – wurde zu verschiedenen Zeitpunkten in den Wachstumskurven von E. coli und B. cereus überwacht, um den Einfluss antiviraler Medikamente während der Phasen des Bakterienwachstums besser zu verstehen. OD ist ein gängiger Ansatz zur Überwachung des Bakterienwachstums in Kultur89. Wir haben die Korrelation zwischen OD und koloniebildenden Einheiten (CFUs) bei unbehandelten Bakterien sowie bei Bedingungen, die Bakterien herausfordern, sowohl mit antiviralen Medikamenten mit antibakteriellen Eigenschaften als auch mit antiviralen Medikamenten ohne mutmaßliche antibakterielle Eigenschaften untersucht und festgestellt, dass OD signifikant mit CFU korreliert (Supplementary Data). 2). Da die Verwendung von OD Messungen mit hohem Durchsatz ermöglichte, verwendeten wir OD (Absorption 600 nm) als Indikator für das Bakterienwachstum, um die Wirkung antiviraler Medikamente auf Bakterien in Kulturen zu überwachen.

Die bei 600 nm gemessene optische Dichte (OD) wurde zur Messung des Bakterienwachstums für E. coli, B. cereus und BAA-2471 verwendet. Um das Wachstum nach der Kultivierung in T25-Kolben zu messen, wurde die OD mit einem UV/Vis-Spektrophotometer Ultrospec 3100 pro von Amersham Biosciences gemessen, das auf die Messung der Absorption bei 600 nm eingestellt war. Die OD von mit antiviralen Mitteln oder Antibiotika behandelten Bakterien wurde über 24 Stunden bei einer auf 25 °C eingestellten Temperatur mit einem Biotek Synergy H1 Multimode-Mikroplattenlesegerät gemessen, das mit der Software Gen5 Version 3.09 ausgestattet war.

Mikrotiterplattenbasierte Tests wurden verwendet, um die Wirkung von Virostatika und Antibiotika auf Bakterien zu untersuchen. Für alle Experimente wurden 5 ml LB-, TSB- oder Difco-Nährbrühe in einem belüfteten T25-Kolben mit einer Bakterienschleife aus gefrorenen Glycerinvorräten einzelner Kolonieisolate beimpft. Die Kulturen wurden 4–5 Stunden lang in einem auf 37 °C eingestellten Inkubator gezüchtet. Nach der anfänglichen Inkubation wurde die OD der Kulturen gemessen und die Bakterien auf eine OD von 0,1 verdünnt. Unter Verwendung von Mehrkanalpipetten wurden 180 μl Bakterien, verdünnt auf eine OD 0,1, in jede Vertiefung von sterilen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (BD Falcon 353072) gegeben. Für jede Vertiefung wurden 20 μl antivirales Mittel oder Antibiotikum und MilliQ-Wasser (Vehikelkontrolle) hinzugefügt, um ein Volumen von 200 μl in jeder Vertiefung zu erreichen. Mit dem Mikroplatten-Lesegerät Biotek Synergy H1 wurde ein festgelegtes Protokoll entwickelt und zum Auslesen der Mikroplatten für jedes Experiment angewendet. Die Platten wurden direkt nach Zugabe aller Reagenzien (Bakterien, antivirale Mittel oder Antibiotika) abgelesen, um den Zeitpunkt Null (T0) zu messen, wobei die Platte zunächst 1 Minute lang bei 567 cpm im Mikroplatten-Lesegerät geschüttelt wurde. Der Plattenleser wurde dann so eingestellt, dass er automatisch bis zu 18 Stunden lang lief, die OD (600 nm) jeder Vertiefung stündlich abliest und die Platte ansonsten konstant mit linearem Schütteln von 567 cpm schüttelte. Vor Beginn des Experiments wurde das Plattenlesegerät auf 25 °C eingestellt und für die Dauer des Experiments bei 25 °C gehalten. Da 25 °C eine relevante Temperatur für aquatische Systeme wie Kläranlagen und Oberflächengewässer90,91 ist, wurde diese Temperatur für die Versuchsbedingungen gewählt. Nachdem das Plattenlesegerät mindestens 16 Stunden lang konstant laufen gelassen wurde, um OD-Messungen für die gesamte logarithmische Phase des Bakterienwachstums zu erfassen, wurde die Mikroplatte entnommen und in einen Tischinkubator (New Brunswick Scientific Incubator Shaker I2400) überführt, der auf 25 °C eingestellt war und bei dem geschüttelt wurde 100 U/min bis 24 Stunden, woraufhin ein weiterer OD-Wert auf dem Mikroplatten-Lesegerät gemessen wurde. Unmittelbar vor dem Ablesen der Platte nach 24 Stunden wurde die Mikroplatte zunächst für 1 Minute bei 567 cpm linear geschüttelt. Die Antibiotikakonzentrationen für Antibiotika-Kreuzresistenztests wurden auf der Grundlage der veröffentlichten Werte der minimalen Hemmkonzentration (MIC) und der experimentellen Bewertung des Bereichs der Wachstumsreaktion für jeden resistenten Stamm von E. coli und B. cereus in Gegenwart verschiedener Antibiotikakonzentrationen ausgewählt .

Rohdaten der Absorptionswerte vom Mikroplatten-Lesegerät wurden als Excel-Dokument exportiert und dann in Prism (Prism 9 für macOS) eingefügt. Statistische Analysen wurden in Prism und Excel durchgeführt. Um die Bedeutung der antibakteriellen Wirkung von antiviralen Mitteln auf E. coli und B. cereus zu testen, wurden für jeden Zeitpunkt und jede antivirale Konzentration individuelle t-Tests durchgeführt, basierend auf Rohabsorptionswerten dreifach behandelter oder unbehandelter Bakterienvertiefungen aus 96-Well-Mikrotiterplatten. Prism wurde verwendet, um ungepaarte t-Tests mit Welch-Korrektur durchzuführen, wobei eine individuelle Varianz für jede Gruppe angenommen wurde (behandelte vs. unbehandelte dreifache Vertiefungen). Unterschiede wurden als signifikant eingestuft, wenn der p-Wert den Schwellenwert erreichte (p > 0,005 gilt als nicht signifikant, p < 0,005, p < 0,0005 oder p < 0,00005).

Die antivirale Kreuzresistenz von antiviral-resistenten E. coli und B. cereus wurde durch den Vergleich des Wachstums von antiviral-behandelten und unbehandelten antiviral-resistenten Stämmen und Wildtyp-Bakterien bestimmt. Alle mutierten Stämme und der Wildtyp wurden 24 Stunden lang mit 50 μg/ml antiviralem Mittel behandelt, was die Zeit von der logarithmischen Wachstumsphase bis zur stationären Phase darstellte. Für Berechnungen zum Vergleich des Wachstums von unbehandelten und medikamentenbehandelten Wildtyp- und resistenten Stämmen wurden die Absorptionswerte zum Zeitpunkt 16 Stunden verwendet, die den Zeitpunkt des Spitzenwachstums oder das Ende der logarithmischen Phase darstellen. Das prozentuale Wachstum antiviral behandelter Bakterien im Vergleich zu unbehandelten Bakterien wurde auf der Grundlage der Mittelung der Rohabsorptionswerte unter dreifachen Bedingungen für alle getesteten Stämme und Wildtypen berechnet. Antivirale Mittel in DMSO wurden mit der DMSO-Vehikelkontrolle im „unbehandelten“ Zustand verglichen, und antivirale Mittel in Wasser wurden mit der Wasservehikelkontrolle im „unbehandelten“ Zustand verglichen. Das prozentuale Wachstum wurde mit Excel berechnet.

In ähnlicher Weise wurde die Antibiotika-Kreuzresistenz von antiviral-resistenten E. coli und B. cereus durch den Vergleich des Wachstums von antiviral-behandelten und unbehandelten antiviral-resistenten Stämmen und Wildtyp-Bakterien bestimmt. Mutierte Stämme und Wildtyp-Stämme wurden mit Antibiotika in vorab festgelegten Konzentrationen auf der Grundlage der MHK und der unterschiedlichen Reaktion zwischen Wildtyp- und resistenten Stämmen herausgefordert. Das prozentuale Wachstum antibiotikabehandelter Bakterien im Vergleich zu unbehandelten Bakterien wurde auf der Grundlage der Mittelung der Rohabsorptionswerte zum 16-Stunden-Zeitpunkt unter dreifachen Bedingungen für alle getesteten Stämme und Wildtypen berechnet. Die minimalen und maximalen Bereiche für antibiotische Wirkungen wurden durch Vergleich der minimalen und maximalen Absorptionswerte aus dreifachen Bedingungen von antibiotikabehandelten und unbehandelten Vertiefungen berechnet. Das prozentuale Wachstum im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle wurde mit Excel berechnet (Supplementary Data 10).

DNA wurde aus Wildtyp- und antivirenresistenten E. coli extrahiert, die bei 37 °C in LB- oder TSB-Medien bis zur logarithmischen Phase gezüchtet wurden. Bakterielle genomische DNA wurde aus Zellpellets unter Verwendung des PacBio/Circulomics Nanobind CBB-Kits (102-301-900) und nach dem Protokoll des Herstellers für gramnegative Bakterien isoliert. DNA-Proben wurden mit Covaris g-Tubes (Covaris, Woburn, MA) auf eine durchschnittliche Größe von 10–15 kb geschert. Bibliotheken mit Barcodes wurden mit dem SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0 (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA) erstellt. Nach der Adapterligation wurden die Bibliotheken in äquimolaren Mengen gepoolt und dann mit einem BluePippin-Instrument (Sage Science, Beverly, MA) mit einem Cutoff von 10 kb nach Größe selektiert. Der Bibliothekspool wurde mit dem Sequel II Binding Kit 2.2 an Polymerase gebunden. Die Sequenzierung wurde mit dem Sequel II Sequencing Kit 2.0 und einer 8 M SMRT-Zelle auf einem Sequel II-Instrument (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA) durchgeführt. Die resultierenden Daten wurden mit dem Dienstprogramm Lima (SMRT Link 10.2) demultiplext und mit Canu v2.2 und der mikrobiellen Assembly-Pipeline PacBio (SMRT Link 10.2) De-novo-Genomassemblys generiert. Sowohl B. cereus als auch E. coli wurden sequenziert; Eine kontaminierte B. cereus-Probe verhinderte jedoch, dass wir Genomvergleiche zwischen B. cereus-Stämmen durchführen konnten, und wurde daher nicht in die Analyse einbezogen. Die gesamten Basenpaarlängen einzelner zusammengesetzter Contigs sind in den Zusatzdaten 12 angegeben. Die Annotation wurde mit der prokaryotischen Annotationspipeline GALES durchgeführt (frei verfügbar: https://github.com/jorvis/GALES). Die Genome wurden bei der GenBank unter der BioProject-Identifikation PRJA907821 hinterlegt und umfassen die Zugangsnummern: CP115180 (Stavudin-resistenter E. coli B), CP115179 (Lamivudin-resistenter E. coli B), CP11578 (Wildtyp-Referenz-E. coli B), CP117469 (Zidovudin). -resistenter E. coli B), CP117043 (Raltegravir-resistenter E. coli B), CP117044 (Dolutegravir-resistenter E. coli B), CP115968 (Didanosin-resistenter E. coli B).

Die Assemblierungsstatistik bestätigte einen einzelnen Contig für jedes sequenzierte Genom und die für E. coli erwartete Gesamtlänge jedes Genoms (~ 4,6 Millionen Basenpaare) (Supplementary Data 12). Eine vergleichende Analyse der sequenzierten Genome ergab einzigartige Insertionen, Deletionen und Substitutionen einzelner Basenpaare sowie Insertionen und Deletionen mehrerer Basenpaare im Vergleich zu den Wildtyp-Stämmen (Abb. 6, Abb. 7, Zusatzdaten 13). Es wurde festgestellt, dass einige Mutationen in allen sequenzierten antivirenresistenten Mutanten konserviert waren, woraus wir schlussfolgerten, dass es sich insgesamt um ein einzigartiges Mutationsereignis im Wildtyp-Klon während der Selektion für die Sequenzierung handelte (Supplementary Data 13). Alle Mutationen in jedem antivirenresistenten E. coli-Genom wurden auf der Grundlage einer vergleichenden Analyse mit sequenziertem E. coli B-Wildtyp-Isolat (Zugangsnummer CP11578) im selben Lauf wie die antivirenresistenten Stämme identifiziert. Benutzerdefinierte Perl-Skripte und BLAST (Version 2.13.0+) wurden verwendet, um die Startposition und Ausrichtung jedes annotierten antivirenresistenten Genoms anzupassen, da die Startpositionen und Ausrichtungen für jedes Genom in den Rohdaten nicht identisch waren. Die Genkoordinaten wurden dann basierend auf der einheitlichen Startposition für alle Genome nummeriert. Die Codon-Nummern innerhalb jedes Gens (identifiziert mit SnapGene Viewer) wurden verwendet, um die Position der identifizierten Mutationen zu beschreiben, die in den Abbildungen aufgeführt sind. 6,7. Mummer (4.0beta2) und DNASTAR MegAlign Pro (Version: 17.4.2) wurden verwendet, um genetische Unterschiede zwischen Wildtyp- und antivirenresistenten Genomen zu identifizieren. Alle Basenpaarunterschiede zwischen den antiviralresistenten Genomen im Vergleich zum Wildtyp wurden durch die Analyse hervorgehoben. Anschließend wurden DNASTAR MegAlign Pro und SnapGene Viewer (Version 6.1.1) verwendet, um jede identifizierte Basenpaarmutation zu überprüfen und die Sequenz von Wildtyp- und antivirenresistenten Genomen zu vergleichen. Übersetzungen von Aminosäuresequenzen wurden im SnapGene Viewer beobachtet und die Proteinidentität und -sequenz für das Gen, das die Mutation enthielt, wurden erneut mithilfe von Blastx (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) durch Eingabe der FASTA-Sequenz bestätigt und Beschränkung der Suche auf E. coli nach Organismen (taxid:562). Verkürzungsereignisse wurden in antiviral-resistenten Genomen identifiziert, wenn das antiviral-resistente Gen im Vergleich zu Wildtyp-E. coli B sowie Nukleotidsequenzen von anderen E. coli (Taxid:562), die bei GenBank hinterlegt und mit Blastx abgerufen wurden, verkürzt war nach einem frühen Stoppcodon nach einer identifizierten Mutation. Prozentualer Anteil des aufgrund der Mutation verkürzten Proteins, angegeben in den Abbildungen. 6,7, wurde auf der Grundlage eines Vergleichs mit der Länge des B-Gens vom Wildtyp nach dem Stoppcodon im antivirenresistenten Genom berechnet. Für alle in den Abb. berichteten Mutationen. 6, 7, Stoppcodons wurden nach der Mutation aufgrund einer durch die Mutation eingeführten Rahmenverschiebung im Gen beobachtet. Stoppcodons wurden durch Beobachtung der drei aufeinanderfolgenden Nukleinsäuren TAG, TAA oder TGA identifiziert. Der Online-Resistance Gene Identifier (RGI 6.0.1; https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi) wurde verwendet, um Gene innerhalb von Referenz- und Mutantengenomen zu identifizieren, die mit der Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD 3.2.6) übereinstimmen nach perfekten und strengen Matching-Kriterien. Unterschiede in den Gensequenzen innerhalb von Antibiotikaresistenzgenen wurden mithilfe eines benutzerdefinierten Perl-Skripts identifiziert. Wir durchsuchten die Literatur auch nach Hinweisen auf eine Rolle bei der Antibiotikaresistenz von Genen, die die signifikantesten Veränderungen an den Protein-kodierenden Genen enthielten. Alle Skripte, die zum Vergleich der Genome von E. coli B-Wildtyp- und antivirenresistenten E. coli-Stämmen verwendet werden, sind frei verfügbar (https://github.com/spacocha/mutant_strain_comparative_genomics).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten für Abb. 3, 4 und 5 finden Sie in den Zusatzdaten. Alle in die Studie einbezogenen Genome wurden bei der GenBank unter der BioProject-Identifikation PRJA907821 hinterlegt und umfassen die folgenden Zugangsnummern: CP115180 (Stavudin-resistenter E. coli B), CP115179 (Lamivudin-resistenter E. coli B), CP11578 (Wildtyp-Referenz E. coli B). coli B), CP117469 (Zidovudin-resistenter E. coli B), CP117043 (Raltegravir-resistenter E. coli B), CP117044 (Dolutegravir-resistenter E. coli B), CP115968 (Didanosin-resistenter E. coli B).

Alle Skripte, die zum Vergleich der Genome von E. coli B-Wildtyp und antiviral resistenten E. coli-Stämmen verwendet werden, sind auf der folgenden Website öffentlich verfügbar: https://github.com/spacocha/mutant_strain_comparative_genomics.

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Referenzen herunterladen

Die Sequenzierung und Annotation des gesamten Genoms wurde von Maryland Genomics am Institute for Genome Sciences der University of Maryland School of Medicine durchgeführt. Wir danken insbesondere Luke Tallon und Lisa Sadzewicz für ihre Beratung bei der Verwendung der PacBio Sequel II-Plattform. Wir bedanken uns für die Finanzierung durch das Fisher Center Discovery Program der Johns Hopkins University. Wir danken Marsha Wills-Karp und Anthony So für ihr Feedback zum Originalmanuskript.

Abteilung für Umweltgesundheit und Ingenieurwesen, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA

Veronica J. Wallace, Eric G. Sakowski, Sarah P. Preheim und Carsten Prasse

Department of Science, Mount St. Mary's University, Emmitsburg, MD, USA

Eric G. Sakowski

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CP und EGS konzipierten die ursprüngliche Studie und trugen zum Studiendesign, zur Dateninterpretation und -analyse bei. VJW trug zur Konzeption und Gestaltung der Studie bei, führte alle Experimente und Datenerfassungen durch, führte Datenanalysen durch und verfasste das Manuskript. EGS und SPP trugen zur Manuskripterstellung bei. SPP trug zur Dateninterpretation und zum Studiendesign bei, schrieb benutzerdefinierte Skripte, führte die Ausrichtung des gesamten Genoms und die Identifizierung von Basenpaarmutationen durch und führte CARD-Suchen und -Analysen durch. CP stellte die Finanzierung bereit. An der Überarbeitung des Manuskripts waren alle Autoren beteiligt.

Korrespondenz mit Carsten Prasse.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Vikas Sharma und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wallace, VJ, Sakowski, EG, Preheim, SP et al. Bakterien, die antiviralen Medikamenten ausgesetzt sind, entwickeln eine Antibiotika-Kreuzresistenz und einzigartige Resistenzprofile. Commun Biol 6, 837 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05177-3

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Eingegangen: 05. November 2021

Angenommen: 25. Juli 2023

Veröffentlicht: 12. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05177-3

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